Rótulo molecular simplifica e acelera o teste de tuberculose.

Anne Trafton | MIT News

A tuberculose, a doença infecciosa mais letal do mundo, estima-se que infecte cerca de 10 milhões de pessoas por ano e mate mais de 1 milhão anualmente. Uma vez estabelecida nos pulmões, a parede celular espessa da bactéria a ajuda a combater o sistema imunológico do hospedeiro.

Grande parte dessa parede celular é composta por moléculas de açúcar complexas conhecidas como glicanos, mas ainda não se compreende bem como esses glicanos ajudam a defender a bactéria. Uma das razões para isso é a ausência de um método simples para rotulá-los dentro das células.

Os químicos do MIT superaram esse obstáculo, demonstrando que podem rotular um glicano chamado ManLAM usando uma molécula orgânica que reage com açúcares específicos que contêm enxofre. Esses açúcares são encontrados apenas em três espécies bacterianas, sendo a mais notória e prevalente o Mycobacterium tuberculosis, o micro-organismo causador da tuberculose.

Após rotularem o glicano, os pesquisadores foram capazes de visualizar onde ele está localizado dentro da parede celular bacteriana e estudar o que acontece com ele durante os primeiros dias da infecção por tuberculose das células imunes do hospedeiro.

Agora, os pesquisadores esperam usar essa abordagem para desenvolver um diagnóstico que possa detectar glicanos associados à tuberculose, seja em cultura ou em uma amostra de urina, o que poderia oferecer uma alternativa mais barata e rápida aos diagnósticos existentes. Radiografias de tórax e diagnósticos moleculares são muito precisos, mas nem sempre estão disponíveis em países em desenvolvimento, onde as taxas de tuberculose são altas. Nesses países, a tuberculose é frequentemente diagnosticada por cultivo de micro-organismos a partir de uma amostra de escarro, mas esse teste apresenta uma alta taxa de falsos negativos, e pode ser difícil para alguns pacientes, especialmente crianças, fornecerem uma amostra de escarro. Esse teste também requer muitas semanas para o crescimento das bactérias, atrasando o diagnóstico.

“Não há muitas opções boas de diagnóstico, e há algumas populações de pacientes, incluindo crianças, que têm dificuldade em fornecer amostras que possam ser analisadas. Há um grande impulso para desenvolver testes muito simples e rápidos”, diz Laura Kiessling, Professora Novartis de Química no MIT e autora sênior do estudo.

A estudante de pós-graduação do MIT, Stephanie Smelyansky, é a autora principal do artigo, que foi publicado esta semana na Proceedings of the National Academy of Sciences. Outros autores incluem Chi-Wang Ma, pós-doutorando no MIT; Victoria Marando, PhD ’23; Gregory Babunovic, pós-doutorando na Escola de Saúde Pública T.H. Chan da Universidade de Harvard; So Young Lee, estudante de pós-graduação no MIT; e Bryan Bryson, professor associado de engenharia biológica no MIT.

Rotulagem de Glicanos

Os glicanos são encontrados nas superfícies da maioria das células, onde desempenham funções críticas, como mediar a comunicação entre as células. Em bactérias, os glicanos ajudam os micróbios a entrarem nas células hospedeiras, e também parecem se comunicar com o sistema imunológico do hospedeiro, em alguns casos bloqueando a resposta imunológica.

“O Mycobacterium tuberculosis tem uma camada celular realmente elaborada em comparação com outras bactérias, e é uma estrutura rica composta por muitos glicanos diferentes”, diz Smelyansky. “Algo que muitas vezes é subestimado é o fato de que esses glicanos também podem interagir com nossas células hospedeiras. Quando nossas células imunes reconhecem esses glicanos, em vez de enviar um sinal de perigo, elas podem enviar a mensagem oposta, de que não há perigo.”

Os glicanos são notoriamente difíceis de rotular com qualquer tipo de sondas, porque, ao contrário das proteínas ou do DNA, eles não têm sequências distintas ou reatividades químicas que possam ser alvo. E, ao contrário das proteínas, eles não são codificados geneticamente, de modo que as células não podem ser geneticamente modificadas para produzir açúcares rotulados com marcadores fluorescentes, como a proteína fluorescente verde.

Um dos glicanos chave no M. tuberculosis, conhecido como ManLAM, contém um açúcar raro chamado MTX, que é incomum porque possui um tioéster — um átomo de enxofre intercalado entre dois átomos de carbono. Esse grupo químico apresentou uma oportunidade para usar uma pequena molécula de marcador que havia sido previamente desenvolvida para rotular a metionina, um aminoácido que contém um grupo similar.

Os pesquisadores mostraram que poderiam usar esse marcador, conhecido como oxaziridina, para rotular o ManLAM no M. tuberculosis. Eles ligaram a oxaziridina a uma sonda fluorescente e demonstraram que, no M. tuberculosis, esse marcador apareceu na camada externa da parede celular. Quando os pesquisadores expuseram o marcador ao Mycobacterium smegmatis, uma bactéria relacionada que não causa doenças e não possui o açúcar MTX, não observaram nenhum sinal fluorescente.

“Esta é a primeira abordagem que realmente nos permite visualizar seletivamente um glicano em particular”, afirma Smelyansky.

Melhores Diagnósticos

Os pesquisadores também mostraram que, após rotular o ManLAM nas células de M. tuberculosis, poderiam rastrear as células enquanto infectavam células imunes chamadas macrófagos. Alguns pesquisadores sobre a tuberculose haviam hipotetizado que as células bacterianas liberam ManLAM uma vez dentro de uma célula hospedeira, e que esses glicanos livres então interagem com o sistema imunológico do hospedeiro. No entanto, a equipe do MIT descobriu que o glicano parece permanecer nas paredes celulares bacterianas pelo menos durante os primeiros dias da infecção.

“As bactérias ainda têm suas paredes celulares anexadas a elas. Então, pode ser que algum glicano esteja sendo liberado, mas a maior parte dele é retida na superfície da célula bacteriana, o que nunca havia sido mostrado antes”, diz Smelyansky.

Agora, os pesquisadores planejam usar essa abordagem para estudar o que acontece com as bactérias após o tratamento com diferentes antibióticos ou a estimulação imunológica dos macrófagos. Ela também pode ser usada para estudar de forma mais detalhada como a parede celular bacteriana é montada, e como o ManLAM ajuda as bactérias a entrarem em macrófagos e outras células.

“Ter um meio para seguir as bactérias é realmente valioso, e isso permitirá visualizar processos, tanto em células quanto em modelos animais, que antes eram invisíveis”, afirma Kiessling.

Ela também espera usar essa abordagem para criar novos diagnósticos para a tuberculose. Atualmente, está em desenvolvimento um diagnóstico que usa anticorpos para detectar o ManLAM em uma amostra de urina. No entanto, esse teste funciona bem apenas em pacientes com casos muito ativos de tuberculose, especialmente pessoas imunossuprimidas devido ao HIV ou outras condições.

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Usando seu sensor de pequenas moléculas em vez de anticorpos, a equipe do MIT espera desenvolver um teste mais sensível que possa detectar o ManLAM na urina, mesmo quando apenas pequenas quantidades estejam presentes.

“Esta é uma abordagem elegantemente simples para rotular seletivamente a superfície das micobactérias, permitindo o monitoramento em tempo real da dinâmica da parede celular nesta importante família bacteriana. Investigações como essas irão informar o desenvolvimento de estratégias inovadoras para diagnosticar, prevenir e tratar doenças micobacterianas, especialmente a tuberculose, que continua sendo um desafio de saúde global”, afirma Todd Lowary, pesquisador distinto no Instituto de Química Biológica da Academia Sinica, em Taipei, Taiwan, que não esteve envolvido na pesquisa.

A pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, pelos Institutos Nacionais de Saúde, pela Fundação Nacional de Ciência e pela Croucher Fellowship.

Reimpresso com permissão do MIT News.